1 葡萄組織培養的研究與應用

  1.1 葡萄組培研究簡史

  世界上關于葡萄組織培養快速繁殖體系建立工作已取得了跨越式的進展，利用葡萄的葉片、葉柄、單芽莖段等外植體，通過器官發生途徑獲得了再生植株 ;利用葡萄的葉片、莖段等外植體及原生質體，通過體胚發生方式獲得了完整植株，快速形成無性繁殖體系。

  1.2 應用前景及意義

  快速擴繁經濟價值較高或者稀有的植物品種，受到區域、季節變化的局限，很難達到快繁的目的;尤其是在短時間內需要達到一定數量，創造經濟價值高的植物，則需要通過組織離體培養的方法才可以實現。組培作為新興技術,已經廣泛應用于葡萄育種、葡萄種質資源保存、葡萄生產等方面。近年來，新疆黑提葡萄發展非常迅速，對壯大新疆林果經濟和提升百姓生活質量水平起到了巨大的推動作用。對葡萄品種的選育和引進，可在短時間內提供大量優良種苗木，達到生產的需求。

  2 外植體的剪取、消毒

  2.1 外植體的剪取

  外植體剪取以春季和秋季為宜，選擇地上部分生命力旺盛的枝條莖段作為外植體，避免選擇在陰雨天剪取，晴天待露水曬干后剪取，剪取前噴施殺蟲劑和殺菌劑。將采回的黑提葡萄莖段(半木質化，附帶腋芽)用自來水沖洗3～5次，剪去病、蟲、長勢弱枝和大葉片后再剪成2～3 cm Y字小型莖段，放入干燥滅菌的廣口瓶中，加入洗潔精清洗后將洗潔精沖洗干凈，后用蒸餾水沖洗2～3遍。

  2.2 外植體的消毒

  在超凈工作臺上倒入無菌水浸泡并沖洗1次，緩慢倒出無菌水加入75%酒精浸泡7～8 s，快速倒出酒精以免損壞外植體，再使用無菌水沖洗2遍后加入0.1%升汞浸泡，放置7 min左右倒出，使用無菌水沖洗3～4次，取出高壓蒸汽滅菌的濾紙，將莖段放在濾紙上吸干水分，使用無菌剪剪去褐變枝端。外植體莖段消毒滅菌過程務必在超凈工作臺(無菌)進行操作。

  3 培養基的配方及制備

  3.1 培養基的成分

  離體組織培養期間，培養基能提供外植體生長主要的營養物質和生長因子。

  3.1.1 無機營養物

  13種植物生長的必需的元素，即磷(P)、氮(N)、鈣(Ca)、鉀(K)、鎂(Mg)、鋅(Zn)、鉬(MO)、氯(Cl)、硫(S)、鐵(Fe)、硼(B)、錳(Mn)和銅(Cu)，在培養基中加入的鹽類中全部含有。

  3.1.2 有機營養物

  有機營養物主要有2類，其中：有機營養物質可為植物細胞提供碳、氫、氧、氮等必需元素，如糖類、氨基酸及酰胺類;生理活性物質在植物的代謝過程中可起到一定的作用，如煙酸和肌醇等。

  3.1.3 植物生長激素

  植物生長激素包括人工合成生長激素物質以及植物天然的5類激素物質，其中，常用生長素有萘乙酸和吲哚乙酸，常用的細胞分裂素有6-芐基氨基嘌呤，常用的赤霉素類物質，常用的乙烯類物質有乙烯利和乙烯。

  3.1.4 其他附加物

  其他附加物成分對植物細胞生長有促進作用，但不是植物細胞生長所必需。

  固體培養基的必需成分為瓊脂，為降低組織培養物的有害代謝物濃度，可以加入適量的活性炭，以利于植物細胞生長;在快繁進程中由菌類污染造成成百上千組培苗損失的現象較為普遍，適當加入抗生素不僅能挽回大量培養物，而且也能節約大量的物力、時間及人力。

  3.2 培養基的選定

  不同植物體的不同生長階段所需的培養基種類不同，需針對不同階段進行選擇。組培培養使用較廣泛的培養基主要有MS培養基、NN培養基及BR培養基等。其中，MS培養基主要作用于愈傷組織誘導組織分化等階段，葡萄組培常用MS培養基。

  3.3 培養基的制備

  3.3.1 MS培養基母液的制備

  3.3.1.1 母液A(大量元素)

  使用電子天平稱取KNO3(19g)、NH4NO3(16.5g)、MgSO·4H2O(3.7 g)、KH2PO4(1.7 g)、CaCl·22H2O(4.4 g)放入不同燒杯。燒杯中加入少量蒸餾水攪拌均勻使藥品充分溶解，再依次倒入容量瓶加蒸餾水定容至1 000 mL，充分搖勻。

  3.3.1.2 母液B(微量元素)

  使用電子天平稱取NaMoO4·2H2O(0.012 5 g)、H3BO3(0.31 g)、CuSO4·5H2O(0.001 25 g)、MnSO4·4H2O(1.115 g)、CoCL2·6H2O(0.001 25 g)、KI(0.041 5 g)、ZnSO4·7H2O(0.43 g)放入不同燒杯。 燒杯中加入少量蒸餾水攪拌均勻使藥品充分溶解，再依次倒入容量瓶加蒸餾水定容至1 000 mL，充分搖勻。

  3.3.1.3 母液C(鐵鹽)

  使 用 電 子 天 平 稱 量FeSO4·7H2O(1.39 g)、Na2EDTA(1.85 g)，放入不同燒杯。燒杯中加入少量蒸餾水攪拌均勻使藥品充分溶解，再依次倒入容量瓶加蒸餾水定容至500 mL，充分搖勻。

  3.3.1.4 母液D(有機附加物質)

  使用電子天平稱量煙酸(0.025 g)、肌醇(5.0 g)、VB1(0.005 g)、VB6(0.025 g)、甘氨酸(0.1 g)，放入不同燒杯。燒杯中加入少量蒸餾水用玻璃棒攪勻使藥品充分溶解，再依次倒入容量瓶加蒸餾水定容至500 mL，充分搖勻。

  3.3.2 激素的配制

  6BA(0.5mg/mL)、IBA(0.5mg/mL)、NAA(0.5mg/mL)，使用0.1mol/LNaOH或少量95%的酒精溶解。

  3.3.3 MS培養基的熬制

  在1 L水中加瓊脂6 g，糖30 g(水燒至沸騰后先加瓊脂再放糖)，全部溶解后攪拌均勻再次定容至1 L，調節pH至5.8～6.4。

  3.3.4 培養基的分裝

  按照使用的目的和要求將培養基倒入規定的容器中，容器應當有一定的密閉性和透氣性，并且方便高壓蒸汽滅菌，適合植物生長。

  3.3.5 培養基的滅菌

  瓶裝培養基在121℃的溫度下進行高壓蒸汽滅菌15 min。

  3.3.6 培養基的存放

  制備好的瓶裝培養基應置于陰暗、低溫處存放，并標注培養基類型編號以免混淆，宜盡早使用。

4 愈傷組織和瓶苗的培養

  外植體培養2周左右會出現愈傷組織，應關閉燈光或遮光處理，在黑暗條件下愈傷組織生長速度更快，培養基養分耗盡必須更換培養基進行繼代培養;繼代培養過程中應選擇不同的生長激素來調劑不同部位的生長情況：黑提葡萄莖尖愈傷誘導適培養基為IBA 0.10 mg/L+1/2MS+6BA 1.0 mg/L，莖葉分化以IBA 0.10 mg/L+l/2MS+6BA 1.5 mg/L為宜，生根培養以IBA 1.0 mg/L+1/2MS為宜，黑提葡萄組織快繁中使用激素濃度不可過高。

  5 瓶苗的移栽和鍛煉

  當黑提葡萄瓶苗生長至大量粗壯根系、有5～8片葉、高4～8 cm時，則將黑提葡萄瓶苗轉移至室內自然光下鍛煉3 d，使其適應溫室室內環境，再將組培苗瓶蓋打開一半，在溫室內練苗2 d，然后將瓶蓋全部打開1 d。從培養瓶中取出小苗，用清水洗掉根部附著的培養基，以免帶入蛭石導致根腐，移栽前將瓶苗根部快速蘸取低濃度生根劑和多菌靈后移栽于營養缽中，澆水浸透后覆蓋薄膜或搭建拱棚保濕，每2～3 h用噴壺噴1次葉面水(可加少量生根劑);培養環境為20～25℃的溫室條件下，基質溫度高于氣溫溫度佳。經過15 d后，黑提葡萄葉片轉綠增大，出現3～5片新綠嫩葉，新發出白色側根時移入苗床栽植，30 d后葉片逐漸增大，慢慢木質化，成活率達95%以上，便可轉入常規栽培管理。